7 Plan de trabajo y manejo de las muestras
1 Reclutamiento de sujetos de investigación
Se elaborará material informativo como volantes y anuncios en redes sociales, describiendo el objetivo de la investigación y las implicaciones de la participación en el estudio, mismos que serán colocados y difundidos en zonas de tránsito común de la comunidad universitaria; las encuestas y material digital serán difundidos mediante el método de bola de nieve. El tamaño de muestra para esta etapa se especifica en la sección sección8.3.1. Se reclutarán a todos los participantes que deseen responder la encuesta para la etapa de tamizaje.
El material de difusión tanto digital como físico mostrará un código QR, el cual, al ser escaneado, los alumnos podrán registrarse de manera voluntaria en una encuesta breve de tamizaje inicial, la cual consistirá de breves preguntas (consumo actual de CigE, intensidad subjetiva del consumo del mismo, consumo actual de cigarrillos convencionales, invitación a reclutamiento posterior y datos de contacto). A partir de los datos obtenidos mediante este instrumento de tamizaje se seleccionará aleatoriamente a una muestra representativa para la realización de la evaluación completa (Evaluación clínica, prueba MoCA, recolección de muestra de orina). El tamaño de muestra requerido para la segunda etapa se detalla en las secciones 8.3.2 y 8.3.3.
Posterior al contacto se les citará en un área definida de trabajo en donde se explicará las implicaciones del estudio y se ofrecerá a firmar la carta de consentimiento informado. En caso de que los participantes no deseen ser incluidos en el estudio se dará por finalizada la reunión. Si el participante desea ser incluido en el estudio se realizará el proceso descrito en la sección de toma de muestras. La carta de consentimiento informado se muestra en el anexo 4 (ver 16.4).
2 Toma de muestra
2.1 Prueba MoCa y evaluaciones cognitivas
La prueba MoCA será realizada en el consultorio general de la Clínica de diagnóstico ubicado en la Facultad de Estomatología de la Universidad Autónoma de San Luis Potosí en un ambiente silencioso. Previo a iniciar el procedimiento, se medirá el ruido ambiental de fondo procurando que el mismo sea de entre 30 a 60 dB, los cuales serán registrados simultáneamente como control de calidad mediante un sonómetro digital marca Steren modelo HER-404.
La prueba MoCA (duración aproximada 10 minutos) será aplicada utilizando la herramienta digital MoCA DUO® para IOS, siguiendo las instrucciones provistas por MoCA cognition. Posteriormente se aplicará la prueba de retención de dígitos (duración aproximada 2 minutos) utilizando la herramienta publicada en la plataforma PsyToolkit, y la prueba de flancos de Eriksen (duración aproximada de 2 minutos) utilizando la herramienta publicada en Gorilla Experiment Builder. Además, se les proveerá la versión adaptada del cuestionario de intensidad de consumo (duración aproximada 3 minutos) y se dará un periodo de dudas y aclaraciones respecto al estudio (duración aproximada 5 minutos)1–3.
El cuestionario que será aplicado estará dividido en 8 apartados como se indica a continuación:
Datos generales: Edad, sexo, consumo actual de cigarrillos electrónicos.
Frecuencia de consumo: Tiempo de inicio de consumo, veces de uso por semana, estimado de tiempo de duración del dispositivo, número aproximado de usos al día.
Percepción de uso: Percepción del daño a la salud asociado al uso, preferencia de sabor.
Datos sobre el dispositivo preferido: Concentración de nicotina, marca usada.
Dependencia y síntomas de abstinencia: Ansiedad en periodos de abstinencia prolongados, percepción de la idea de ya no consumir, uso inconsciente del dispositivo.
Impulso y control en zonas prohibidas: Uso dentro de zonas prohibidas, modificación de la conducta de uso previo a ingresar a zonas prohibidas.
Interferencia en la rutina diaria: Percepción del consumo como hábito, interferencia en la vida ante la ausencia de uso.
Consumo actual de tabaco convencional: Consumo de cigarrillos, cantidad de consumo, frecuencia, intensidad, consumo pasivo.
Finalmente, se les darán indicaciones para la toma de muestra de orina, las cuales se describen en la sección 7.2.2 Las evaluaciones MoCA serán grabadas en video para su posterior evaluación por un participante del equipo de investigación.
2.2 Muestra de orina
A cada participante se le proporcionará las siguientes recomendaciones para la recolección de orina:
Higiene previa
Lavado de manos mínimo 20 s con agua y jabón neutro.
Secado con toalla de papel desechable o aire limpio.
Limpieza de la zona genital externa con toallita estéril sin alcohol ni agentes quelantes.
No aplicar jabones perfumados, cremas ni talcos antes de la recolección.
Precauciones dietéticas (día anterior)
Evitar consumo de frutos secos, leguminosas, chocolate, té negro, café, mariscos, pan y cereales integrales.
Suspender suplementos minerales o multivitamínicos que contengan cromo o níquel.
Recolección de primera micción
Realizar en ayunas, idealmente después de despertar.
Desechar los primeros 10 a 20 ml (“chorro inicial”).
Recoger el resto en el frasco que se le proveerá (Frasco de polietileno).
Etiquetar con nombre, fecha y hora de recolección.
No exponer la muestra al calor.
Se le solicitará al participante que realice la entrega de la muestra de orina el día de la recolección de la misma.
Una vez en resguardo, se etiquetará la muestra con un código de identificación pseudo aleatorizado y se almacenará en una hielera a una temperatura de entre 4° Celsius hasta su transporte al laboratorio del CIAAS en el CIACyT. El código de identificación anonimizado será resguardado de manera que solo un integrante del equipo de trabajo tenga acceso a la base de datos con el objetivo de evitar la divulgación no autorizada de datos.
2.3 Manejo de la muestra
El transporte de las muestras al laboratorio será realizado por el investigador principal en contenedores isotérmicos provistos de paquetes de gel refrigerante y un termómetro con registro (ThermoPro TP359) para asegurar que el rango de temperatura se mantenga entre 2 °C y 8 °C durante todo el traslado. A su llegada, cada frasco será inspeccionado para descartar fugas o roturas, para posteriormente ser almacenadas a -20 °C hasta su análisis.
3 Procesamiento
3.1 Muestras de orina
Para determinar la concentración de niquel y cromo, las muestras serán procesadas en un espectrofotómetro PinAAcle 900T (ver Figura 1).
Para el procesamiento de la muestra de orina, se transferirá el contenido del frasco de polietileno a tubos Corning con capacidad de 15ml previamente etiquetados. Se seguirá el proceso de digestión ácida según lo descrito en el proceso EPA SW-846 método 3015A.
Previamente al proceso de digestión, se transferirán 5 mL de orina y 3 mL de HNO₃ al 50% a vasos de teflón, manteniéndolos en predigestión durante 15 minutos bajo campana de extracción. A continuación, cada vaso será provisto de una camisa de asbesto y se colocará en un carrusel de procesamiento para ingresarlos al microondas de digestión CEM-MarX (CEM Corporation, EUA). El programa de digestión comienza con una rampa de calentamiento de diez minutos hasta alcanzar 200 °C, seguida de un mantenimiento de la misma temperatura durante quince minutos; todo el ciclo se desarrolla a una presión constante de 200 psi y con una potencia de 1600 W.
Para trazar la curva de calibración se prepararán las soluciones patrón para cromo y níquel siguiendo el protocolo establecido para el PinAAcle 900T, el cual consiste en la preparación de viales de muestreo de 1.2 mL en los cuales se pipetearán 100 µL de cada solución estándar reconstituida en 900 µL de HNO3, mezclando 5 veces; el blanco se prepara con 100 µL de diluyente. Cada estándar se analizará en duplicado y, mediante el software WinLab32 for AA, se generará una curva de calibración lineal forzada al origen cartesiano con ponderación 1/x, aceptándose sólo aquellas con un valor de R² ≥ 0.995.
El horno será programado para cromo a 357.9 nm con apertura de ranura de 0.5 nm y para níquel a 232.0 nm con apertura de 0.2 nm, siguiendo un ciclo de secado, pirólisis, atomización y limpieza
Para el control de calidad de los resultados se empleará el estándar ClinChek® Urine Control lyophilised (RECIPE, niveles I y II), reconstituyendo cada vial con 10 ml de agua analítica o bidestilada y dejando disolver el material liofilizado durante 15 min, tal como indica el fabricante. Tras la digestión asistida por microondas, se calculará el porcentaje de recuperación establecido como la razón entre la concentración medida y el valor certificado.
Una vez validada la calibración, las muestras de orina ácida digerida se inyectarán en volúmenes de 20 µL y se empleará argón de alta pureza como gas de arrastre (250 mL/min en pirólisis y 300 mL/min en atomización). Finalmente, cada corrida incluirá un blanco de digestión y un control intermedio de 15 µg/L, validándose sólo si la recuperación se encuentra entre el 85% y el 115%, repitiéndose en caso contrario.
Posterior al procesamiento y registro de los resultados del análisis, las muestras serán desechadas siguiendo lo establecido por la NOM-087-ECOL-SSA1-2002.
3.2 Pruebas cognitivas
Las videograbaciones y evaluaciones MoCA serán revisadas por un evaluador diferente al aplicador con el propósito de disminuir sesgos. Se seguirán las recomendaciones de evaluación provistas por MoCA Cognition. La prueba de amplitud de dígitos y la prueba Flanker se realizará utilizando las herramientas previamente descritas (PsyToolkit y Gorilla builder), mismas que también serán videograbadas para control de calidad interno.
3.3 Almacenamiento y manejo de base de datos
Los datos obtenidos a través de las pruebas clínicas y la cuantificación urinaria de metales serán ingresados a una base de datos de SQL a través de una plataforma de captura de datos clínicos elaborada con Shiny y Rstudio, alojada en un servidor docker con la finalidad de mantener la seguridad del resguardo de los datos. Se utilizará la aplicación desarrollada por Christian Stubbe denominada LCARS-C, la cual aloja un sistema de almacenamiento de datos basado en SQL encriptado4.
El sistema electrónico de captura de datos clínicos consta de una plataforma digital alojada en un dominio web accesible a través de autenticación, el cual está enlazado a un contenedor digital de base de datos SQL Mariadb. Los datos almacenados en esta se encuentran encriptados con el objetivo de mantener la seguridad y privacidad de los mismos, los cuales únicamente pueden ser accedidos por el investigador y con la posibilidad de ser auditadas. Dicha base de datos se encuentra enlazada con un contenedor de RStudio server para la realización del análisis estadístico, manteniendo la encriptación de los datos y disminuyendo el riesgo de filtración de datos.
Se utilizará el software MySQL Workbench para la consulta de los datos y R para adecuar la estructura de la base de datos4 (Figura 2).
